Électrophorèse en gel d'agarose
L'agarose est un polymère qui forme un maillage plus ou moins dense selon sa concentration.
Le principe de l’électrophorèse sur gel d'agarose repose sur la séparation des molécules d’acides nucléiques via les mailles formées par l'agarose.
La séparation des acides nucléiques est influencée par 2 critères : la taille et la conformation spatiale
En effet, plus une molécule d'ADN est grosse, plus elle sera ralentie dans les mailles du gel. Elle migrera donc moins loin qu'une molécule plus petite.
Cependant, la conformation spatiale de l’ADN joue également un rôle important dans la migration. Un ADN relâché va migrer moins loin qu’un ADN linéarisé, qui lui-même va migrer moins loin qu’un ADN surenroulé, pour une molécule de même taille.
Cette séparation est possible car à pH basique, l’ADN (ou l’ARN) est chargé négativement de par les charges portées par ses groupements phosphates. Par conséquent, sous l’impulsion d’un champ électrique (de l'ordre de 100 V), l’ADN va migrer vers l’anode en fonction de sa taille.
Afin de visionner les bandes sur le gel correspondant aux molécules d'ADN de taille ou de conformation différentes, on ajoute lors de la préparation du gel un intercalant de l'ADN. Cet intercalant a pour rôle de s'incorporer dans l'ADN et d'émettre une fluorescence proportionnelle à la quantité de molécule intercalante incorporer.
Il existe de nos jours plusieurs intercalant de l'ADN, les principaux sont le BET (Bromure d'éthidium), le GelRed et le SYBR Safe. Les deux derniers ont pour caractéristique d'être moins toxique, pas ou peu mutagène, pas ou peu cancérigène.
Électrophorèse en gradient de dénaturant
Cette technique (DGGE : Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) permet de séparer des molécules d'ADN de même taille à l'aide d'un gradient en dénaturant chimique. Les agents chimiques utilisés pour réaliser le gradient sont : (i) l'urée (ii) le formamide. Le facteur influant la migration des molécules d'ADN est le pourcentage en bases G et C (GC%) de la séquence.
On utilise en gel de polyacrylamide (bis-acrylamide) car ce dernier à une résolution à la paire de bases près permettant ainsi de détecter des mutations.
Les molécules d'ADN au cours de la migration vont rencontrer des conditions de dénaturation croissante. Plus un fragment d'ADN a un GC% élevé plus il aura besoin d'une concentration importante en dénaturant pour se dénaturer et donc migrera plus loin. Un fragment peu riche en GC% sera rapidement dénaturé et donc migrera moins loin.
La migration des fragments d'ADN est stoper à l'aide d'une région comportant une répétition de GC (GC Clamp). Ce GC Clamp est ajouté lors de la PCR via une amorce comportant un GC Clamp à son extrémité 5'. Cela permet lors de la migration dans le gel dénaturant, la non-dénaturation complète du fragment d'ADN ainsi que de l'ouverture du brin que d'une seule extrémité.
Deux séquences ne variant seulement d’une paire de bases ou ayant une composition différente, vont donc s’ouvrir à deux moments différents, et donc migrer à deux endroits différents.
Cette technique est notamment utilisée afin d'évaluer la diversité bactérienne d'un échantillon. On amplifie, par exemple, la région variable de l'ADN codant l'ARNr 16S des bactéries. Après migration et en théorie, chaque bande correspond à une espèce bactérienne différente.
