Le clonage moléculaire

Le principe du clonage consiste à insérer un fragment d’ADN étranger dans un plasmide et à le dupliquer au sein d’un organisme hôte.

Pour cela, un fragment d’ADN est inséré dans un vecteur. Le plus souvent les types de vecteurs utilisés sont les plasmides = molécule d’ADN extrachromosomique, circulaire, bicaténaire, de petite taille et possédant une origine de réplication qui lui permettra de se répliquer de manière autonome dans une cellule.

Pour qu’un plasmide soit utilisé en tant que vecteur de clonage, il doit posséder au minima:
- une origine de réplication adaptée au type de la cellule hôte (eucaryote/procaryote)
- un site de clonage multiple (MCS : « Multiple Cloning Site »)
- un ou plusieurs gènes permettant la sélection (ex : résistance à un antibiotique, Lac Z a, marqueur d'auxotrophie)

Le fait de faire rentrer de l'ADN étranger au sein d'une cellule hôte s'appelle une transformation chez les procaryotes. Le plus souvent, la transformation se fait par choc thermique (bref passage à 42°C afin d'élargir les nanopores créés dans les membranes et ainsi que de stimuler l'entrée du plasmide). On peut également effectuer une transformation par électroporation (on soumet les cellules et l'ADN à un bref et intense champ électrique).

Chez les eucaryotes le terme exact n'est plus transformation mais transfection d'une cellule par de l'ADN nu étranger.
La transfection de cellules peut se faire selon différentes méthodes :
- co-précipitation avec le phosphate de calcium : l'ADN est dissous dans du chlorure de calcium puis est mélangé à du phosphate. Il y a formation d'un précipité qui sera internalisé dans la cellule par endocytose.
- lipofection : complexation de l'ADN a transfecté avec des lipides cathioniques. Ces complexes forment des pseudos-liposomes qui vont pouvoir rentrer dans la cellule sous forme de vésicule.
- électrotransfection : électroporation
- micro-injection
- nucléofection

La transformation des bactéries par le chlorure de calcium

Le chlorure de calcium (CaCl2) permet grâce aux ions divalents Ca2+ de former des nanopores réversibles dans la membrane des bactéries.
En effet, la membrane bactérienne est notamment constituée d'une double couche de phospholipides chargés négativement par leur phosphate. Ces derniers vont permettre la création de nanopores réversibles par le Ca2+ comme expliqués ci-dessous.

Le TA-Cloning

Le "TA-Cloning" est une méthode de clonage simple et rapide. Le principe de cette méthode repose sur le fait que les ADN polymérases dépourvues d’activité exonucléase de 3’ vers 5’ (dont la Taq polymérase) ajoutent préférentiellement une Adénine (A) supplémentaire en 3’ en fin d’élongation.

Par le biais de vecteur de clonage fournis linéarisés avec une Thymine (T) sortante à chaque extrémité 3'OH (par exemple : pGEM-T), l'insertion du fragment d'intérêt sera facilité, grâce à la complémentarité des bases.

Cependant, l'insertion du fragment n'est pas orienté! En vue d'un futur séquençage, cela n'est pas nécessaire.

La sélection des clones recombinés s'effectue le plus souvent avec le système blanc/bleu de l'opéron lactose